Los cultivos celulares: una herramienta clave

Los científicos han desarrollado metodologías para aislar células y obtener, a partir de ellas, poblaciones homogéneas que luego pueden ser analizadas, e incluso multiplicarse in vitro (“en vidrio” = en el laboratorio). Esto ofrece ventajas en la investigación básica ya que permite estudiar diversos procesos que ocurren en las células, y en la investigación aplicada para la producción de moléculas de interés, ingeniería de tejidos, entre otras.
 
Las células pueden ser aisladas y separadas en diferentes tipos
El primer paso para aislar células del mismo tipo a partir de un tejido (formado por células de diversos tipos) es separar la matriz extracelular que las une. Para lograrlo, la muestra de tejido es tratada con diversas enzimas proteolíticas (como tripsina y colagenasas) que degradan las proteínas de la matriz; también se utilizan agentes (como el EDTA – ácido etilendiaminotetraacético-) que pueden secuestrar al ion calcio, del cual depende la adherencia celular. De esta forma, y mediante una suave agitación, se obtiene a partir del tejido, una suspensión celular con más de un tipo de célula, probablemente.
Se pueden utilizar varios métodos para separar los diferentes tipos celulares de la suspensión celular, según sus propiedades:
1. La diferencia de tamaño de las células permite separarlas por centrifugación.
2. La capacidad que tienen algunos tipos celulares de adherirse al vidrio o al plástico, permite separarlos de otras células que se adhieren débilmente.
3. Algunos anticuerpos se unen específicamente a sustancias presentes en determinadas células. Luego, se emplea diferentes matrices (como colágeno, bolitas de polisacáridos, plástico) a la cuales sólo las células reconocidas por los anticuerpos podrán adherirse. Las células pueden, luego, recuperarse por agitación, por tratamiento con tripsina que digiere  las proteínas que median la adhesión o, en el caso de una matriz digerible (como el colágeno), degradando la propia matriz con enzimas (como la colagenasa).
4. Se emplean anticuerpos acoplados a colorantes fluorescentes para marcar células específicas adheridas a ellos. Las células marcadas por interacción con el anticuerpo pueden ser separadas de las no marcadas en un separador de células activado por fluorescencia o cell sorter.


Figura 1. Equipo para la separación de células activado por fluorescencia. Las células individuales viajan a través de un conducto muy delgado y son iluminadas por un láser. El equipo puede detectar qué células emiten fluorescencia (por el anticuerpo adherido). Cada célula es incorporada en una gota que es “cargada” eléctricamente como negativa o positiva en función de la presencia o ausencia del colorante fluorescente. Luego, las gotas son separadas por un campo eléctrico hacia los recipientes colectores según su carga (adaptado de Alberts y col., MBC 2002).

5. Disección de un grupo de células a partir de una sección de tejido que ha sido preparada para microscopía (ver Cuaderno N° 80). La región que contiene las células de interés es irradiada  con un pulso de láser infrarrojo, que funde un pequeño círculo con las células que están por debajo. Estas células capturadas son luego removidas para mayor análisis. La técnica, denominada “microdisección de captura por láser”, puede utilizarse, por ejemplo, para aislar diferentes partes de un tumor, y analizarlas. Otra técnica relacionada emplea un láser para disectar un grupo de células y catapultarlas a un contenedor apropiado para comenzar los análisis de las mismas.

   
Figura 2. Técnica de microdisección para seleccionar células aisladas a partir de porciones tisulares. Este método emplea un láser para escindir una región de interés y eyectarla a un contenedor, permitiendo el aislamiento aún de una célula individual a partir del tejido. (Fuente: Alberts y col., MBC 2004).
 Una vez que se obtiene una población homogénea de células, la muestra puede emplearse para análisis bioquímicos. También provee del material de partida para aumentar el número de células y establecer un cultivo que permita estudiar el comportamiento celular en una placa de cultivo (que no es igual que interaccionar con el resto del organismo).

 Las células pueden ser crecidas en una placa de cultivo
La mayoría de las células animales y vegetales aisladas pueden vivir, multiplicarse e incluso expresar propiedades diferenciales, si se les provee un medioambiente apropiado en una placa de cultivo. Así, las células pueden ser observadas continuamente bajo el microscopio o analizadas bioquímicamente, con la utilidad de explorar los efectos del agregado o remoción de moléculas específicas, tales como hormonas o factores de crecimiento, al cultivo celular. Además, mezclando dos tipos celulares, las interacciones entre ellas pueden ser estudiadas. Cuando los experimentos se realizan sobre cultivos celulares, se dice que son experimentos “in vitro” (“en vidrio”), para diferenciarlos de los experimentos que se llevan a cabo en organismos completos, a los que se denomina “in vivo” (“en el organismo viviente”).
El cultivo de tejidos y células comenzó en 1907 con un experimento diseñado para esclarecer una controversia en la neurobiología por el investigador Dr. Ross Harrison (figura 3), quien trabajaba en la Universidad Johns Hopkins. El investigador publicó un breve pero crítico artículo (“Observaciones de la fibra nerviosa viva en desarrollo”) que introdujo exitosamente una nueva técnica, el cultivo de tejidos, para demostrar experimentalmente cómo las fibras nerviosas se originan. Los experimentos originales en fibras nerviosas se basaron en el cultivo de pequeños fragmentos de tejidos, llamados “explantos”.
Utilizando técnicas asépticas desarrolladas para la manipulación de embriones de ranas, Harrison tomó a partir de uno de ellos, fragmentos del tubo neural (tejido embrionario precursor del sistema nervioso), depositándolo en una gota de líquido linfático fresco (“medio de cultivo”) de rana colocada sobre un cubreobjetos estéril (figura 3). Una vez que la linfa coaguló, invirtió el cubreobjetos sobre un portaobjetos de vidrio que poseía una depresión, creando así un cultivo en gota suspendida, técnica utilizada por los microbiólogos para estudiar las bacterias. Luego de periódicas observaciones al microscopio, pudo describir el desarrollo de fibras nerviosas in vitro a partir de las neuronas presentes en el tejido extirpado. Así, además de argumentar sólidamente la “doctrina neural”,  resolvió los problemas básicos del cultivo celular, como el medio, la observación y la contaminación.
Distintos tipos de cultivos celulares
Actualmente, los cultivos se establecen principalmente a partir de suspensiones celulares generadas por disgregación de tejidos (explicado anteriormente). A diferencia de las bacterias, la mayoría de las células obtenidas de tejidos no están adaptadas para vivir en suspensión, y requieren una superficie sólida en la cual crecer y dividirse. Para los cultivos celulares, este soporte está generalmente provisto por la superficie de una placa de cultivo plástica. De todas formas, como las diferentes células varían en sus requerimientos, a veces el crecimiento y diferenciación de las mismas sólo se logra recubriendo el soporte plástico con componentes de la matriz extracelular (sustancia que rodea y contiene a las células en los tejidos, con la cuál interactúan), como por ej. colágeno y laminina.

Los cultivos se pueden clasificar en:


Con este experimento, el cultivo de células comenzó su camino para convertirse en una gran herramienta tanto para la investigación como para la producción de anticuerpos monoclonales, vacunas y productos farmacológicos a gran escala.


  • Cultivos primarios

Se denomina cultivo primario a aquellos cultivos preparados directamente a partir de los tejidos de un organismo, sin proliferación (multiplicación) in vitro. Este tipo de cultivo puede iniciarse con o sin fraccionamiento para separar los distintos tipos celulares. En la mayoría de los casos, las células de los cultivos primarios pueden ser removidas del recipiente de cultivo a uno nuevo donde proliferarán para formar varios cultivos secundarios.

  • Cultivos secundarios

En estas condiciones, las células suelen crecer hasta cubrir la superficie del recipiente de cultivo, formando una monocapa (capa de una célula de espesor), donde como consecuencia del contacto entre las células se detiene temporalmente su proliferación, hasta que se las subcultiva a un recipiente con medio fresco; así podrán subcultivarse durante semanas o meses. En este estadio, las células frecuentemente mostrarán distintas propiedades en función de su origen. Por ejemplo, los fibroblastos (células que sintetizan fibras y mantienen la matriz extracelular del tejido de muchos animales) secretarán colágeno; las células derivadas de tejido muscular esquelético se fusionarán para generar fibras musculares con capacidad contráctil espontánea; las células nerviosas extenderán prolongaciones (axones) eléctricamente excitables que podrán conectarse (establecer sinapsis) con otras células nerviosas; las células epiteliales formarán largas capas con varias propiedades de un epitelio intacto (figura 4). Gracias a que estos fenómenos ocurren en cultivo, es posible estudiarlos con diferentes metodologías, a veces no aplicables a tejidos intactos.


  • Cultivos continuos o Líneas celulares

La mayoría de las células de los vertebrados cesan su división celular luego de un número finito de divisiones en cultivo, por un proceso llamado senescencia celular. Por ejemplo, los fibroblastos humanos normales se dividen solamente entre 25 y 40 veces en cultivo, antes de detenerse. En estas células, así como en muchas otras, la capacidad limitada de proliferación es el resultado de un acortamiento progresivo de los telómeros (porción de ADN que se encuentra en los extremos de los cromosomas). En las células somáticas (todas las células que no son células sexuales) se encuentra “apagado” el gen que codifica para la enzima telomerasa, que se encarga de mantener la integridad de los telómeros; como consecuencia, los telómeros se acortan en cada división celular. A los fibroblastos humanos se los puede forzar a proliferar indefinidamente si se les provee el gen que codifica para la telomerasa; así, pueden propagarse como una línea celular “inmortalizada”.
Pero como se mencionó, no todas las células humanas se inmortalizan de la misma manera. Algunas células, a pesar de que sus telómeros permanezcan largos, pueden frenar sus divisiones celulares como consecuencia de la activación de mecanismos denominados “puntos de control” (check points) del ciclo celular. Para inmortalizar estas células, hay que lograr la inactivación de los check-points. Una forma de hacerlo es introducir ciertos “oncogenes” (genes promotores del cáncer) que pueden ser obtenidos de virus cancerígenos (como algunas cepas de HPV o virus del papiloma humano, adenovirus, etc.).
A diferencia de las células humanas, las de los roedores no tienen “apagado” el gen de la telomerasa, por lo que sus telómeros mantienen el largo a través de las divisiones celulares. Pero cuando son cultivadas, esas células experimentan cambios genéticos que inactivan los mecanismos de check-point, produciendo líneas celulares inmortalizadas espontáneamente.
Ambos tipos de líneas celulares son muy útiles en la investigación celular, como fuente de un gran número de células uniformes, que pueden ser conservadas y almacenadas en nitrógeno líquido (a -196°C) por un período muy largo de tiempo, reteniendo su viabilidad, y constituyen un buen modelo experimental para las primeras etapas de una investigación.
A pesar de la gran similitud que las células de una línea tienen entre sí, no son idénticas. La uniformidad genética en una línea celular puede mejorarse por clonado celular, donde una única célula es aislada y prolifera para formar una gran colonia de células clonales. Una de las aplicaciones más importantes de esta estrategia es el aislamiento de líneas celulares mutantes que poseen defectos en ciertos genes. La información que su estudio puede proporcionar es de gran valor, ya que permite inferir el rol que la proteína ausente o alterada tiene en las células normales.
Entre los cultivos celulares más polémicos y promisorios, desde un punto de vista médico, se encuentran las líneas de células madre embrionarias humanas (ver Cuaderno N° 83). Estas células, obtenidas del macizo celular interno de un embrión en los primeros estadios del desarrollo, pueden proliferar indefinidamente reteniendo la habilidad de originar cualquier tipo celular del cuerpo. Estos cultivos celulares podrían potencialmente revolucionar la medicina al proveer de células capaces de reemplazar o reparar tejidos dañados. Otra fuente de células madre que se está investigando es el tejido adulto.
 
 ¿Qué son los hibridomas?
Se sabe que es posible fusionar dos células formando un heterocarionte, es decir, una célula con dos núcleos separados pero con los contenidos citoplasmáticos compartidos. Para lograrlo, una suspensión de células es tratada con compuestos que inducen la fusión de membranas (fusógenos), tales como ciertos virus o el compuesto polietilenglicol (PEG). Eventualmente, un heterocarionte puede entrar en mitosis, produciendo una célula híbrida en la cual las envolturas de ambos núcleos se han disgregado, permitiendo juntar los cromosomas de ambos en un único gran núcleo. Tales células híbridas pueden clonarse estableciendo una línea celular, pero se sabe que en muchos casos la línea resultante es inestable genéticamente, y tiende a perder parte del material genético.
En 1975, un equipo integrado por el científico argentino Dr. César Milstein desarrolló, mediante la técnica de fusión, una línea celular híbrida clave para la producción de anticuerpos monoclonales (todos iguales) para fines de diagnóstico y terapéuticos: los hibridomas (este desarrollo llevó al Dr. Milstein a ser galardonado con el Premio Nóbel). Los hibridomas son líneas celulares resultantes de la fusión de dos tipos celulares: un linfocito B secretor de inmunoglobulinas (anticuerpos) y una línea celular derivada de un tumor de linfocitos B. Los linfocitos B secretores de anticuerpos se generan mediante la inmunización de una rata o ratón con un antígeno de interés contra el cual se quieren generar los anticuerpos. Se obtiene como resultado una mezcla heterogénea de células híbridas, seleccionándose a partir de ellas aquellas células con la capacidad de producir el anticuerpo deseado y de proliferar indefinidamente. Estos hibridomas son propagados como clones individuales, cada uno de los cuáles provee una fuente estable y permanente de un único tipo de anticuerpo monoclonal (figura 5). Dicho anticuerpo reconoce un único epítope antigénico (es decir, por ej., un grupo particular de 5-6 aminoácidos en una conformación espacial también específica). Entre las ventajas de los hibridomas frente a un cultivo clonal de un linfocito B secretor particular, está que los mismos tienen una vida limitada en cultivo.


Figura 5. Preparación de hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales contra un antígeno en particular. Aquí el antígeno de interés es designado como “antígeno X”. El medio de crecimiento selectivo utilizado luego del paso de fusión celular, contiene un inhibidor (aminopterina) que bloquea las rutas biosintéticas normales por las cuales se sintetizan los nucleótidos. Como consecuencia, las células deben utilizar una vía alternativa para fabricar sus ácidos nucleicos. Esta vía es defectiva en la línea celular mutante derivada del tumor de linfocitos B, pero está intacta en las células obtenidas del ratón inmunizado. Debido a que ninguna de las células utilizadas para la fusión inicial puede crecer por sí sola, solo las células híbridas sobreviven. Adaptado de Alberts y col., MBC 2004.

¿Qué contienen los medios para el cultivo de células?
Hasta los años ´70, el cultivo de tejidos parecía resultar de la fusión entre la ciencia y la brujería. De a poco, los fluidos coagulados (como en el experimento de Harrison) fueron reemplazados por placas con medios líquidos que contenían pequeñas cantidades de una serie de moléculas necesarias para la supervivencia y multiplicación celular: sales, glucosa, aminoácidos y vitaminas; además, la mayoría de los medios incluían una mezcla poco definida de macromoléculas adicionadas bajo la forma de suero fetal bovino o equino, o extracto crudo de embriones de pollo.  Dichos medios se siguen utilizando en la actualidad (ver tabla 3, para cultivo de células animales) para los cultivos de rutina, generando la dificultad para muchos investigadores en conocer cuáles son las macromoléculas específicas que un dado tipo celular requiere para funcionar normalmente.
Como consecuencia se desarrollaron numerosos medios químicamente definidos, denominados “libres de suero”, que poseen, además de las pequeñas moléculas mencionadas, varias proteínas específicas necesarias para la supervivencia y proliferación, como factores de crecimiento (estimulan la proliferación celular).
Así se descubrieron muchas moléculas de señalización extracelulares esenciales para la supervivencia, desarrollo y proliferación de determinados tipos celulares, gracias a estudios que buscaban establecer las condiciones mínimas de cultivo para un comportamiento celular adecuado.
Otro componente de importancia para los medios de cultivo son compuestos indicadores de pH. Los mismos le otorgan color al medio, que puede ir virando hacia otro color en función de los cambios de acidez del medio, permitiendo monitorear un parámetro muy importante para el cultivo celular.

Tabla 3. Composición de medios de cultivo para células eucariotas animales.

 

 
*Penicilina y estreptomicina son antibióticos adicionados para suprimir el crecimiento de bacterias contaminantes. El rojo fenol es un colorante indicador de pH cuyo color es monitoreado para asegurar que el pH sea aproximadamente 7,4. Los cultivos crecen usualmente en contenedores de plástico o vidrio con una superficie apropiada para la adhesión celular. Los contenedores con el cultivo se mantienen en una estufa a 37°C en una atmósfera de 5% de CO2, 95% aire.

  Cultivos celulares y una variedad de contenedores
Existen numerosos dispositivos diseñados para realizar cultivo de tejidos, dependiendo de las características de las células a cultivar, y de la dimensión de cultivo que se quiera alcanzar.
La mayoría de los cultivos de tejidos o células se llevan a cabo en pequeña escala, donde un número de células relativamente pequeño es necesario para realizar experimentos. En dicha escala, las células crecen frecuentemente en frascos de entre 25 a 175 cm2, una medida que se refiere a la superficie de uno de los lados sobre el cuál las células se adhieren y crecen (ver figura 6: frascos T). En un recipiente típico de 175cm2, el rendimiento es de aproximadamente 1×107 células de una línea adherente, y 1×108 células de líneas que crecen en suspensión (siempre dependiendo del tipo celular). En los frascos T estándares, no es posible producir cantidades mayores de células, dada la cantidad de tiempo insumida para los repetidos pasajes necesarios a medio fresco, la demanda de espacio en un incubador (que controla la composición de gases, la temperatura y la humedad del entorno) y el costo.
Cuando se considera aumentar la escala del cultivo (escalado o scaling-up), se deben tener en cuenta numerosos parámetros, incluyendo problemas asociados a la depleción de nutrientes, el intercambio gaseoso (especialmente depleción de oxígeno), y la aparición de metabolitos tóxicos como el amonio y el ácido láctico.



Figura 6. Distintos contenedores para cultivo de células. A) Frasco T; b) Frasco triple; c) botellas rodantes; d) biorreactor; e) frasco con paletas; f) frascos con agitación (erlenmeyer).
Fotos:
www.sigma-aldrich.com

 Existen muchos sistemas para escalar los cultivos celulares, que se muestran en la figura 6. Entre ellos, es posible encontrar desde arreglos de frascos triples y botellas cilíndricas, hasta biorreactores más complejos en su estructura. En todos los casos, es necesario asegurar el correcto intercambio gaseoso y la disponibilidad de nutrientes. Por ejemplo, el arreglo de botellas de cultivo sobre rodillos que se muestra en la figura 6 (c), está diseñado de forma tal que las células cubran toda la superficie interna de la botella, con rodillos que al girar aseguran que el medio de cultivo bañe a todas las células, aportándole nutrientes y retirando desechos. Otro ejemplo es el biorreactor (d) que permite obtener un rendimiento importante de anticuerpos a partir de un cultivo celular. 
La adición de bolitas de distintos materiales inertes puede ayudar también a aumentar la densidad celular en cultivos al aumentar la superficie de cultivo entre 10 y 100 veces.

Tabla 4. Tipo de contenedores para cultivo de células y sus capacidades

Como ya se mencionó, las finalidades de los cultivos de células son múltiples, desde la investigación básica hasta muchas aplicaciones biotecnológicas. Entre estas aplicaciones se pueden mencionar: la producción de compuestos de interés farmacológico y otros en células animales (anticuerpos, eritropoyetina, etc.), reparación de daño tisular mediante cultivo de células madre (en desarrollo), producción de compuestos de interés en células vegetales, transformación vegetal empleando como explanto un cultivo celular, etc. 

Fuente: ArgenBio / http://www.porquebiotecnologia.com.ar/educacion/cuaderno/ec_98.asp?cuaderno=98

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